CRISPR став потужнішим, завдяки «вимикачу»
При всіх своїх приголомшливих можливості редагування генів, механічно CRISPR нагадує електроінструмент з поламаним вимикачем. Просто вдумайтеся: весь механізм CRISPR вибудовується в пробірці, а після завершення він завжди активний, включений, працює. Після введення тваринам або людям, CRISPR починає блукати по всьому тілу в пошуках цільового гена, який повинен змінити або знищити, поки не втратить силу і не засвоїться організмом.
Послаблення контролю молекулярного електроінструменту, очевидно, не буде ідеальним рішенням: він може перестаратися і поламати нецільові гени. І якщо щось піде не так, немає негайного способу вимкнути механізм, перш ніж він завдасть шкоди.
На початку цього місяця команда з Каліфорнійського університету в Берклі спробувала приручити звіра CRISPR. Використовуючи техніку кругової перестановки, команда реорганізувала CRISPR в програмований інструмент ProCas9, який тихо ховається в клітинах, поки його не розбудять зовнішні чинники — наприклад, вірусна інфекція.
Цей «додатковий рівень безпеки» обмежує навички редагування CRISPR підмножиною клітин «для точної різання», говорить автор дослідження доктор Девід Севідж.
Більш того, ProCas9 може потенційно реагувати на логічні вхідні дані, такі як «і» або «ні», що означає, що він буде активовано тільки при дотриманні певного набору інструкцій — наприклад, «ця ракова клітина» або «ця клітина інфікований» призведе до відповіді «пожертвувати кліткою», який активує CRISPR і дасть йому вказівку різати гени, необхідні для виживання. Дослідження було опубліковане в престижному журналі Cell.
Взяти під контроль CRISPR
Давайте трохи освіжити в пам’яті: CRISPR, як інструмент редагування генів, насправді являє молекулярний дует. Перша частина, напрямна РНК, це крихітні криваві гончаки, які шукають цільовий ген.
Як тільки ген захоплений, другий компонент — Cas9 — активується для виконання розрізання. На відміну від напрямних РНК, які складаються з генетичних букв, Cas9 є білком. Саме з цим компонентом вирішили пограти вчені з Берклі.
«Широка мета нашої роботи — приборкати і для використання людьми і прибрати непотрібні речі, які не належать до редагування геному», говорить Севідж.
Що ж можна зробити з білком? Уявіть собі дуже довгий ланцюжок пронумерованих кульок (амінокислот), зім’ятих в складну тривимірну структуру. Розріжте ланцюг і зможете реорганізувати намистини так, щоб їх положення на нитки відрізнялося від вихідного, і скласти їх у вузол або два при повторному з’єднання білкової нитки.
Саме це, по суті, зробила команда. Цей трюк називається «кругової перестановкою» і перетворює вихідний білок так, що у нього з’являється новий початок і кінець — і він складається в іншу форму. Це величезна операція на молекулярному рівні, яка зазвичай руйнує функцію білка.
Автори кажуть, що не були впевнені, що це спрацює з чимось таким складним, як Cas9.
Дивно, але Cas9 виявився майже тестом. Команда спробувала розрізати його в безлічі точок, перш ніж знайти відрізи, які зберігали функцію білка, але в 10% випадків пересобранный Cas9 працював майже так само, як і оригінал.
Тут є один розумний момент: при повторному з’єднанні білкових ниток команда прослизнула в молекулярні «ворота» — невеликий лінкер — які блокували ріжучу здатність Cas9, якщо сам лінкер не був зламаний.
Що ж розбивало ланцюга? Набір ферментів, званих протеазами.
Протеазочувствительный лінкер
Уявіть протеази як крихітні ножиці для білка, які плавають в тілі. Їх ціла сім’я: хороші допомагають нам перетравлювати стейки і боби. Але є і погані. Ракові клітини, наприклад, відкачують свої власні «злі» протеази, які розривають навколишні тканини, сприяючи їх зростанню. Віруси також можуть секретувати вірусні протеази, що часто необхідно для їх проникнення в множинні клітини і тканини. Зіка і денге є одними з тих, хто використовує протеази в якості своєї зброї, а протеази від заражають рослини вірусів допомагають оскверняти картоплю та інші культури.
Але протеази не ріжуть по своєму бажанню. Швидше, кожна з них призначена лише для невеликого числа амінокислотних послідовностей — «поштових індексів», які вона розпізнає і розрізає.
Це означає, що команда може помістити певний поштовий індекс, що відповідає певній протеазе — наприклад, ракових клітин — у реорганізований білок Cas9 як лінкера. Таким чином, лінкер буде різати тільки в клітинах, які мають цю специфічну протеазу, а значить і буде включатися тільки в цих клітинах. Залежно від направляючої РНК, команда може спроектувати активоване CRISPR, щоб розрізати гени, необхідні для виживання — і тим самим вбивати ракову клітку.
В цьому сенсі нові білки Cas9, що отримали назву ProCas9 («pro» з-за «протеази»), перетворюються в крихітні шпигунські машини, які стають смертельно небезпечними після активації.
Вбивця-альтруїст
Щоб перевірити концепцію, вчені представили інфіковані Зіку клітини своєму новому ProCas9, оснащеному направляючими РНК, навченими для пошуку генів, які підтримують життя клітин.
Всього за тиждень нова система CRISPR знищила інфіковані клітини в якості «альтруїстичної захисту». Здорові клітини залишилися живі і недоторканим.
Це показало, що система залишалася спокійною в мирний час, таким чином, обмежуючи геномний шкоди хазяїну, каже автори.
В окремих експериментах система ProCas9 працювала так само добре, приносячи в жертву інфіковані вірусом Західного Нілу клітини.
«Хоча це дуже раннє підтвердження концепції, воно демонструє ідею того, що це може бути синтетична імунна система», говорить автор дослідження Бенджамін Оукс. «Ми створили білок, виявляє приховану загрозу, який можна запрограмувати на що завгодно».
Нова система CRISPR навряд чи завадить нашій імунній системі. Ще одним перевагу перебудови білка є те, що його нові кінці краще переносять вантажі, такі як інші модифікуючі ДНК ферменти або індикатори, що світяться в темряві.
Ніби Cas9 обзавівся новою суперсилою, яка дозволяє нам відстежувати, де в клітці знаходиться білок, або ж змінювати експресію певних генів — замість того, щоб безпосередньо псувати наш генетичний матеріал.
Команда з Берклі вже передбачила кілька варіантів використання. ProCas9 буде корисний для молекулярного скринінгу або відкриття ліків. Або ж він може обмежити обрізання ДНК певними клітинами «після загальної доставки редактирующего комплексу в цільову тканина або орган», що значно підвищить профіль безпеки інструменту, особливо в клінічних умовах.
Але найцікавіше в усьому цьому те, що ми не прив’язані до механізму CRISPR, яким нас наділила природа. Ці білки можна ретельно оптимізувати і посадити у каркаси, що не зустрічаються в природі, але володіють необхідними властивостями для використання в клітинах людини, дослідження чи лікування, говорить Севідж.
А які застосування нового інструменту бачите ви?
